文献一（Chambers et al., 2013）方法说明

测量原理

基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，通过“沉淀-固相萃取（PPT-SPE）”两步法富集目标物，结合亚2 μm填料色谱柱实现高效分离，最终利用多重反应监测（MRM）模式检测特立帕肽的多电荷态离子，核心逻辑如下：

1. 样品前处理：采用乙腈（含5%氨水）沉淀蛋白去除基质干扰，再以弱阴离子交换SPE柱（Oasis HLB）选择性富集特立帕肽，避免非特异性吸附。
2. 色谱分离：使用ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水（A相）和乙腈（B相）为流动相，通过快速梯度洗脱（15%→50% B in 3.6 min）实现特立帕肽与内标（人PTH 1-38）的基线分离，总运行时间6 min。
3. 质谱检测：
   • 电离方式：电喷雾正离子化（ESI+），利用特立帕肽的多电荷态特性（+5、+6电荷态）提高离子化效率。
   • 离子对选择：监测特立帕肽的+5（m/z 687.05→787.26）、+6（m/z 824.25→983.79）电荷态离子，以及内标的+4 y32离子（m/z 984→854.80），通过优化碰撞能量（CE 18 eV、25 eV）提升检测选择性。
4. 定量依据：以特立帕肽与内标的峰面积比定量，线性范围覆盖15–500 pg/mL（200 μL进样体积），满足临床“高灵敏度”需求。

操作步骤

一、样品前处理

1. 试剂与材料：

   • 沉淀剂：乙腈（含5%氨水，v/v）。
   • SPE柱：Oasis HLB（1 mL，Waters）。
   • 内标：人PTH 1-38（2 ng/mL，DMSO溶解）。
   • 洗脱液：60%乙腈（含34%三氟乙醇（TFE）、1%三氟乙酸（TFA），v/v）。

2. 操作流程：

   • 沉淀：取200 μL人血清样本，加入20 μL内标溶液（2 ng/mL）和200 μL沉淀剂 → 涡旋混匀5 min → 4000 rpm离心15 min。
   • SPE活化：SPE柱依次用1 mL甲醇、1 mL水活化（保持柱床湿润）。
   • 上样与洗涤：将离心后上清液加载至SPE柱，用1 mL 5%甲醇水溶液洗涤2次（去除弱极性干扰物）。
   • 洗脱：用2 × 25 μL洗脱液分两次洗脱（利用TFE增强特立帕肽溶解度，TFA调节酸性环境）→ 氮气吹干后，用25 μL水复溶 → 4000 rpm离心5 min，取上清液待测。

二、色谱条件

• 系统：ACQUITY UPLC（Waters）。
• 色谱柱：CSH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm，Waters）。
• 流动相：
  • A相：0.1%甲酸水溶液；
  • B相：乙腈。
• 梯度程序：
  时间（min）	流速（mL/min）	%A	%B	功能描述
  初始	0.4	85	15	初始平衡
  0.01	0.4	85	15	保持初始比例
  3.60	0.4	50	50	线性洗脱目标物
  3.61	0.4	10	90	快速冲洗残留物
  5.00	0.4	10	90	冲洗阶段
  5.01	0.4	85	15	平衡至初始条件
• 柱温：60℃（优化大分子多肽的分离效率）；进样量：200 μL（提升灵敏度）。

三、质谱条件

• 系统：Xevo TQ-S（Waters）。
• 离子源参数：
  • 毛细管电压：3.0 kV；源温度：150℃；脱溶剂温度：600℃；
  • 锥气流量：150 L/h；脱溶剂气流量：1000 L/h。
• MRM参数：
  • 特立帕肽：
    • +5电荷态：Q1 > Q3（m/z 687.05 → 787.26），锥孔电压45 V，碰撞能量18 eV；
    • +6电荷态：Q1 > Q3（m/z 824.25 → 983.79），锥孔电压45 V，碰撞能量25 eV；
  • 内标（人PTH 1-38）：Q1 > Q3（m/z 984.00 → 854.80），锥孔电压45 V，碰撞能量22 eV；
  • 驻留时间：0.06 s（平衡离子传输时间）。

四、方法验证关键参数

• 线性范围：15–500 pg/mL（r² > 0.99，n=8）。
• 精密度：QC样本（Low: 30 pg/mL, Medium: 150 pg/mL, High: 400 pg/mL）的日内%RSD为4.6–8.2%（n=6）。
• 准确度：QC样本的相对误差（%RE）为-6.2%至+5.8%。
• 基质效应：6个不同血浆源的基质因子CV为5%（IS归一化后），表明基质干扰可控。

注意事项：

1. TFA使用：洗脱液中TFA易导致质谱离子抑制，需严格控制浓度（≤1%），且需频繁清洁质谱锥孔以防止残留。
2. 色谱柱维护：CSH C18柱对多肽分离更优，但需避免高比例有机相（>90% B）长时间冲洗，建议梯度终点后立即平衡至初始条件。
3. 进样体积：200 μL大体积进样虽提升灵敏度，但需确保样品澄清（离心后进样），避免针尖堵塞。

文献二（Kusuma et al., 2021）方法说明

测量原理

基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，通过固相萃取（SPE）富集目标物，结合亚2 μm BEH C18色谱柱实现快速分离，最终利用+7电荷态离子检测特立帕肽，核心逻辑如下：

1. 样品前处理：采用Strata-X-A弱阴离子交换SPE柱选择性富集特立帕肽，通过“重力流上样+多次洗脱”减少非特异性吸附，复溶液含1% BSA以阻断管壁吸附。
2. 色谱分离：使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm），以0.5%甲酸水（A相）和乙腈（B相）为流动相，通过短梯度洗脱（20%→90% B in 3 min）实现分离，总运行时间4 min。
3. 质谱检测：
   • 电离方式：电喷雾正离子化（ESI+），利用特立帕肽的**+7电荷态离子**（m/z 589.3）提高检测灵敏度。
   • 离子对选择：监测特立帕肽的+7（m/z 589.3→656.3）电荷态离子，以及内标（大鼠PTH 1-34）的+6（m/z 677.4→778.6）电荷态离子，通过优化碰撞能量（CE 12 eV、18 eV）提升选择性。
4. 定量依据：以特立帕肽与内标的峰面积比定量，线性范围覆盖15.07–913.3 pg/mL（30 μL进样体积），满足临床“宽浓度范围”需求。

操作步骤

一、样品前处理

1. 试剂与材料：

   • SPE柱：Strata-X-A（30 mg/1 mL，Phenomenex）。
   • 内标：大鼠PTH 1-34（5 ng/mL，水溶解）。
   • 复溶液：含1% BSA的乙腈-水-甲酸溶液（78:20:2, v/v）。
   • 洗脱液：乙腈-水-甲酸（80:18:2, v/v）。

2. 操作流程：

   • 样本准备：取600 μL人血清样本，加入50 μL内标溶液（5 ng/mL）→ 涡旋混匀。
   • SPE活化：SPE柱依次用1 mL甲醇、1 mL水活化（避免柱床干燥）。
   • 上样与洗涤：将样本重力流加载至SPE柱（避免高压），用1 mL有机混合液（甲醇-水 50:50, v/v）洗涤2次（去除弱极性干扰物）。
   • 洗脱：用1.5 mL洗脱液分两次洗脱（每次0.75 mL，重力流模式）→ 60℃氮气吹干。
   • 复溶：加入200 μL复溶液（含1% BSA）→ 涡旋混匀 → 4000 rpm离心5 min，取上清液待测。

二、色谱条件

• 系统：ACQUITY UPLC（Waters）。
• 色谱柱：BEH C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，Waters）。
• 流动相：
  • A相：0.5%甲酸水溶液；
  • B相：乙腈。
• 梯度程序：
  时间（min）	流速（mL/min）	%A	%B	功能描述
  初始	0.3	80	20	初始平衡
  0.80	0.3	80	20	保持初始比例
  1.20	0.3	78	22	早期洗脱
  2.20	0.3	73	27	主洗脱阶段
  2.70	0.3	70	30	目标物洗脱
  3.00	0.3	10	90	冲洗残留物
  3.50	0.3	10	90	冲洗阶段
  3.75	0.3	80	20	平衡至初始条件
  4.00	0.3	80	20	结束运行
• 柱温：50℃（平衡BEH C18柱对多肽的吸附）；进样量：30 μL（小体积进样减少柱压）。

三、质谱条件

• 系统：Xevo TQ S（Waters）。
• 离子源参数：
  • 毛细管电压：3.0 kV；源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；
  • 锥气流量：150 L/h；脱溶剂气流量：1000 L/h。
• MRM参数：
  • 特立帕肽：Q1 > Q3（m/z 589.3 → 656.3），锥孔电压40 V，碰撞能量12 eV；
  • 内标（大鼠PTH 1-34）：Q1 > Q3（m/z 677.4 → 778.6），锥孔电压40 V，碰撞能量18 eV；
  • 驻留时间：0.06 s（平衡离子传输时间）。

四、方法验证关键参数

• 线性范围：15.07–913.3 pg/mL（r² > 0.99，n=11）。
• 精密度：QC样本（LLOQ: 15.07 pg/mL, Low: 43.38 pg/mL, Middle: 377.2 pg/mL, High: 725.4 pg/mL）的日内%RSD为6.36–10.85%（n=24）。
• 准确度：QC样本的相对误差（%RE）为96.71%–100.88%。
• 基质效应：8个不同血浆源（含溶血、脂血）的IS归一化基质因子为0.97–1.06（CV < 6%），表明基质干扰可忽略。

注意事项：

1. BSA作用：复溶液中1% BSA可阻断特立帕肽在进样管/自动进样器中的非特异性吸附，需现配现用以避免沉淀。
2. SPE操作：Strata-X-A柱需重力流上样（避免高压导致柱床破坏），洗脱液需新鲜配制（甲酸易挥发，影响pH）。
3. 梯度优化：短梯度（3 min）虽提升通量，但需确保特立帕肽与内标完全分离（保留时间~3.53 min），建议定期校准梯度计时器。

方法依据

• 文献一：Chambers E.E., Bardsley J., Fountain S.O. et al., Journal of Chromatography B, 2013, 938, 96–104.
• 文献二：Kusuma M.B., Kashibhatta R., Gavande A. et al., Journal of Chromatography B, 2021, 1187, 123046.

两篇文献的方法在前处理策略（PPT-SPE vs 单纯SPE）、色谱柱类型（CSH C18 vs BEH C18）、质谱离子对选择（多电荷态 vs 单一+7电荷态）等核心环节存在显著差异，需严格区分描述以确保方法特异性。